Aumento del rendimiento de hiPSC en el cultivo de células madre en biorreactores
Robert Zweigerdt de la Escuela de Medicina de Hannover explica cómo su equipo aumentó considerablemente el rendimiento de hiPSC en el cultivo de células madre en biorreactores.
Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y su progenie diferenciada proporcionan el conjunto de herramientas para enfoques innovadores en medicina regenerativa. Los biorreactores de tanque agitado son sistemas de cultivo prometedores, ya que tienen la capacidad de producir un alto número de células, lo que permite oportunidades de ampliación y de vanguardia para mejorar el control de los parámetros de crecimiento, con numerosos beneficios, el principal de los cuales es una mejor reproducibilidad del cultivo.
El aumento de la densidad celular es un componente vital de la investigación en bioprocesamiento de células madre. En esta entrevista, el Dr. Robert Zweigerdt de la Facultad de Medicina de Hannover, Alemania, explica cómo su equipo alcanzó un rendimiento de cultivo de 35 millones de hiPSC por ml.
Eppendorf: Su grupo tiene experiencia establecida en el cultivo de hiPSC como agregados celulares en biorreactores de tanque agitado. En su última publicación, informó haber alcanzado una densidad celular de 35 millones de células por ml. ¡Eso es un gran salto! ¿Qué obstáculos importantes tuviste que superar para alcanzar este hito?
RZ: El primer obstáculo, que atacamos hace una década, fue apoyar la supervivencia y proliferación de hiPSC sembradas en un cultivo en suspensión sin matriz tridimensional (3D), en contraste con los protocolos de cultivo establecidos que emplean cultivo en monocapa dependiente de matriz 2D en Platos y tarimas de cultivo convencionales 1, 2 .
El segundo gran paso, realizado en colaboración con su empresa, fue el diseño de un impulsor de agitación modificado que admitía una agregación hiPSC 3 más homogénea y, posteriormente, un sistema de “filtro de retención”. Dichos sistemas de retención permiten mantener las células hPS, que forman agregados multicelulares en cultivo en suspensión agitada, en el biorreactor con alimentación de perfusión automatizada, definida como el reemplazo constante del medio usado por medio fresco 4 .
Posteriormente, la alimentación por perfusión fue el requisito previo para nuestro último paso: es decir, la identificación de parámetros limitantes del crecimiento, como la dependencia del pH, el consumo de glucosa y la acumulación de lactato. Habiendo identificado estos cuellos de botella que limitan el crecimiento, se realizó un monitoreo basado en retroalimentación que requiere el control del rendimiento total del medio a través de la alimentación por perfusión. El Dr. Felix Manstein, de nuestro departamento, que estaba impulsando estas investigaciones en los últimos años, también ha implementado estrategias de modelado y optimización de procesos in silico , que facilitan el desarrollo racional de procesos de bioprocesamiento de alta densidad de hiPSCs 5 .
Eppendorf: Para un uso prospectivo en terapias avanzadas, las hiPSC deben diferenciarse en el tipo de célula deseado. ¿Qué tan sencillo fue traducir los protocolos de diferenciación que se diseñaron para cultivos monocapa a agregados celulares en biorreactores?
RZ: Desde que iniciamos el desarrollo de estrategias de diferenciación específicas de linaje en suspensión hace varios años, poco después de la primera cultura hiPSC exitosa en 3D 6 , también hemos establecido un grado sustancial de competencia en esa área. Los desafíos más importantes con respecto a la diferenciación dirigida en cultivo en suspensión incluyen el impacto del tamaño de los agregados celulares, su heterogeneidad, la densidad celular general y la definición de parámetros mecánicos e hidrodinámicos 7 .
Sin embargo, también observamos que los componentes de los medios de cultivo estándar y las moléculas directoras de diferenciación que estamos aplicando, como por ejemplo los moduladores de la vía WNT, utilizados para la inducción del mesendodermo y la diferenciación cardíaca, tienen efectos equivalentes en 2D y en 3D 8 . Por lo tanto, la transición del proceso de 2D, que a menudo se aplica para la investigación básica de diferenciación celular, a la cultura de suspensión 3D suele ser sencilla. Sin embargo, estamos convencidos de que en el futuro muchas estrategias de diferenciación se beneficiarán de las capacidades avanzadas de control de procesos habilitadas por las tecnologías de biorreactores, aún en las primeras etapas de desarrollo 9 .
En particular, demostramos que la diferenciación de hiPSC basada en biorreactor de tanque agitado es aplicable de manera eficiente no solo para la difracción cardíaca (como se destaca en las referencias anteriores) sino también para la diferenciación y producción de muchas otras progenies de hiPSC funcionales, incluidas las células endoteliales 10 macrófagos 11 y endodérmicos derivados 12 .
Eppendorf: En el bioprocesamiento previo, la estrategia de alimentación tiene un gran impacto en el crecimiento y la viabilidad de las células. Los lotes repetidos y la perfusión son dos opciones para eliminar los subproductos y reponer los nutrientes. ¿Cuáles considera que son los pros y los contras de estas dos estrategias?
RZ: Como se mencionó anteriormente, nuestra experiencia sugiere que la alimentación por perfusión, a pesar de su complejidad, es la táctica óptima para el cultivo avanzado de hPSC 13 . Esto se debe al metabolismo altamente glucolítico de la hPSC de rápido crecimiento, que, por un lado, requiere un enorme suministro de glucosa adicional para evitar la inanición que limita el crecimiento. Además, por otro lado, la suplementación alta en glucosa da como resultado una acumulación masiva de lactato secretado, que puede volverse tóxico y que induce una acidificación inhibidora de la proliferación del cultivo. Estos problemas aumentan exponencialmente en paralelo al aumento exponencial de la densidad celular 5.
Por estas razones, creemos que la alimentación por perfusión es la estrategia más exitosa para controlar los parámetros limitantes del crecimiento, si el objetivo del protocolo es optimizar el cultivo de alta densidad de hiPSC. En particular, en paralelo al aumento de 10 veces en la densidad celular, la cantidad de medio necesaria para generar un número determinado de células se redujo en un 70 % como consecuencia de los pasos de optimización del proceso.
Eppendorf: En unos pocos años, pudo aumentar la densidad de cultivo hiPSC más de diez veces. ¿Cómo optimizó su proceso para obtener este valor?
RZ:Hace un par de años, obtuvimos 2,85 millones de hiPSC por ml luego de la inoculación con 0,5 millones de células por ml. Recientemente, obtuvimos una densidad celular más de 10 veces mayor después de una densidad de inoculación comparable. Seguimos una estrategia paso a paso, analizamos sistemáticamente los desafíos y luego aplicamos el control combinado de los parámetros habilitado por el biorreactor, superando así los obstáculos que limitan el crecimiento. Los cuellos de botella específicos incluyen: promover la supervivencia y agregación eficientes de hiPSC después de la inoculación del proceso basado en una sola célula, la adaptación adecuada de la velocidad de agitación para garantizar que no se agrupen las hiPSC y la reducción del diámetro del agregado por debajo de ~300 µm. Luego, evitando la caída del pH por debajo de alrededor de 6.7,5 .
Sin embargo, una vez que se identifican estas limitaciones, pueden controlarse sistemáticamente a través del software de control de bioprocesos y optimizarse en combinación con el modelado de procesos in silico ; detalles en nuestro protocolo más reciente 14 .
Eppendorf: Pudiste generar 5250 millones de hiPSC en un volumen de 150 ml. ¿Cómo se compara ese número con el número de células requeridas para aplicaciones de terapia celular, por ejemplo, para el corazón? ¿Ve la necesidad de una futura ampliación?
RZ: A pesar de este progreso sustancial del bioprocesamiento de hiPSC pluripotentes e indiferenciadas, todavía estamos trabajando para aumentar aún más la densidad celular y, por lo tanto, el rendimiento de células diferenciadas, incluidos los cardiomiocitos derivados de hiPSC. Si bien hemos logrado una pureza de linaje muy alta, por ejemplo, > 95 % de cardiomiocitos iPSC, la densidad celular obtenida del protocolo de diferenciación sigue siendo relativamente baja; actualmente ca. _ 1-2×10 6 células por ml 8 . Dado que las estimaciones sugieren que para el reemplazo de los miocitos cardíacos agotados por la enfermedad, alrededor de 1-2×10 9Se requerirán iPSC-cardiomiocitos para cada paciente, actualmente requeriríamos alrededor de un cultivo de 1 litro para proporcionar la dosis de células adecuada para un paciente individual.
Los investigadores de medicina regenerativa están discutiendo la posibilidad de generar lotes de células muy grandes para un enfoque de trasplante alogénico, no específico del paciente, por lo que creemos que sería apropiado seguir un programa de mejora sustancial en el futuro. Este objetivo apuntaría a volúmenes de cinco, diez, veinte, cien veces y, finalmente, niveles aún mayores.
Dicha estrategia de mejora también es muy atractiva desde una perspectiva comercial, que incluye la transición a condiciones GMP totalmente controladas requeridas para el cumplimiento normativo y la traducción clínica.
En relación al cultivo de células madre en biorreactores, otro enfoque prometedor es el “cultivo de células sanguíneas”, como por ejemplo la diferenciación de macrófagos funcionales de hiPSC. Como demostramos recientemente en colaboración con el grupo de Ncio Lachmann en el campus de la Escuela de Medicina de Hannover, este enfoque, en contraste con la producción por lotes de cardiomiocitos hiPSC, es compatible con la producción continua de macrófagos en biorreactores de tanque agitado durante varias semanas o más. incluso meses 11 .
Eppendorf: Teniendo en cuenta la densidad celular, ¿todavía ve margen de mejora? ¿Cuáles son los factores limitantes?
RZ : Como se indicó anteriormente, vemos margen de mejora para el bioprocesamiento de progenies hiPSC diferenciadas. Los factores (limitantes) para la diferenciación son aún más complejos en comparación con la expansión de hiPSC en el estado pluripotente. Las razones de esto incluyen la mayor complejidad de los procesos de diferenciación, ya que las células cambian constantemente su estado de progenitores y fenotipo y, por lo tanto, su fisiología y propiedades de proliferación. Estamos trabajando intensamente para desarrollar condiciones de proceso específicas de linaje que expresen numerosos linajes diferentes.
¡Es una tarea desafiante pero, por lo tanto, inspirador y emocionante!
Referencias:
[1] Cultivo en suspensión inoculado de células individuales de aumento de escala de células madre embrionarias humanas. Singh H, et al. Res. de células madre 2010 mayo;4(3):165-79. doi: 10.1016/j.scr.2010.03.001. Epub 2010 Mar 12.
[2] Expansión escalable de células madre pluripotentes humanas en cultivo en suspensión. Zweigerdt R, et al. Protocolo Nat. 2011 mayo;6(5):689-700. doi: 10.1038/nprot.2011.318. Epub 2011 Apr 28.
[3] Cultivo en suspensión de células madre pluripotentes humanas en biorreactores agitados controlados. Olmer R, et al. Tissue Eng Parte C Métodos. 2012 octubre; 18 (10): 772-84. doi: 10.1089/ten.TEC.2011.0717. Epub 2012 4 de junio.
[4] Impacto de las estrategias de alimentación en la expansión escalable de células madre pluripotentes humanas en biorreactores de tanque agitado de un solo uso. Kropp C, et al. Células madre Transl Med. 2016 octubre; 5 (10): 1289-1301. doi: 10.5966/sctm.2015-0253. Epub 2016 Jul 1.
[5] Bioprocesamiento de alta densidad de células madre pluripotentes humanas mediante control metabólico y modelado in silico. Manstein F, et al. Células madre Transl Med. 2021 julio; 10 (7): 1063-1080. doi: 10.1002/sctm.20-0453. Epub 2021 Mar 4.
Referencias:
[6] Control de expansión y diferenciación cardiomiogénica de células madre pluripotentes humanas en cultivo de suspensión escalable. Kempf H, et al. Informes de células madre. 2014 9 de diciembre; 3 (6): 1132-46. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.09.017. Epub 2014 30 de octubre.
[7] Diferenciación cardíaca de células madre pluripotentes humanas en cultivo en suspensión escalable. Kempf H, et al. Protocolo Nat. 2015 de septiembre; 10 (9): 1345-61. doi: 10.1038/nprot.2015.089. Epub 13 de agosto de 2015.
[8] El control WNT continuo permite el procesamiento cardíaco hPSC avanzado y la identificación de marcadores de superficie de pronóstico en cultivos de suspensión químicamente definidos. Halloin C, et al. Informes de células madre. 13 de agosto de 2019; 13 (2): 366-379. doi: 10.1016/j.stemcr.2019.06.004. Epub 2019 Jul 25.
[9] Predicción del resultado de la diferenciación cardíaca de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante el modelado de procesos multifactoriales. Williams B, et al. Frente Bioeng Biotechnol. 23 de julio de 2020; 8:851. doi: 10.3389/fbioe.2020.00851. eCollection 2020.
[10] Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en células endoteliales funcionales en cultivo en suspensión escalable. Olmer R, et al. Informes de células madre. 2018 8 de mayo; 10 (5): 1657-1672. doi: 10.1016/j.stemcr.2018.03.017. Epub 2018 Apr 19.
[11] La producción en masa basada en biorreactores de macrófagos humanos derivados de iPSC permite inmunoterapias contra infecciones bacterianas de las vías respiratorias. Ackermann M, et al. Nat Comun. 30 de noviembre de 2018; 9 (1): 5088. doi: 10.1038/s41467-018-07570-7.
Referencias:
[12] Producción escalable, libre de xeno y definida químicamente de agregados de endodermo definitivos derivados de hPSC con potencial de diferenciación de múltiples linajes. Sahabian A, et al. Células. 4 de diciembre de 2019; 8 (12): 1571. doi: 10.3390/celdas8121571.
[13] Avances y desafíos en la expansión a gran escala de células madre pluripotentes humanas Christina Kropp C, et al. Process Biochemistry Volumen 59, Parte B, agosto de 2017, páginas 244-254.
[14] Control de procesos y estrategias de modelado in silico para permitir el cultivo de alta densidad de células madre pluripotentes humanas en biorreactores de tanque agitado. Manstein F, et al. Protocolos STAR, 9 de diciembre de 2021; 2 (4): 100988. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100988. eCollection 2021 17 de diciembre.