La digitalización es una gran promesa para aumentar la eficiencia, la calidad y la reproducibilidad del bioprocesamiento aguas arriba. Desde la automatización de una ejecución de bioprocesos, la optimización de procesos a través de modelos y métodos estadísticos, soluciones digitales para el mantenimiento de equipos y el manejo de datos basados ​​en la nube, la digitalización puede beneficiar muchas facetas de la bioproducción.

Un libro electrónico producido en colaboración entre Eppendorf y GEN (Genetic Engineering & Biotechnology News) explora el valor y la adopción de la digitalización en el bioprocesamiento con artículos sobre las personas detrás de las herramientas digitales, ejemplos de automatización de procesos y cómo la IA puede transformar los flujos de trabajo de bioprocesamiento.

Las personas son la clave de la evolución digital de la biofarmacia

Existe una clara tendencia hacia la adopción de la fabricación digital en la industria biofarmacéutica, y los expertos citan la globalización, la complejidad de la cadena de suministro, los precios y la presión de los costos como impulsores clave para adoptar esta innovación. Véronique Chotteau, PhD, del grupo de tecnología celular del Royal Institute of Technology (KTH) de Suecia, dice que la nueva voluntad de invertir en tecnologías de fabricación innovadoras refleja el surgimiento de una nueva generación de ejecutivos que entienden sus beneficios para la bioproducción compleja basada en células. Además, el creciente interés en los bioprocesos continuos requiere herramientas avanzadas para el monitoreo en línea (tecnología analítica de procesos) y controles de retroalimentación en comparación con la operación por lotes heredada.

Sin embargo, Chotteau reconoce que hay una escasez de personal con experiencia en fabricación digital, lo que podría desacelerar el impulso, particularmente con modalidades más desafiantes como la terapia celular y génica. Superar el conocimiento aislado en todas las disciplinas y aumentar el apoyo académico en bioprocesamiento contribuirá en gran medida a abordar la escasez de personal en los próximos años y aumentar la competencia en el espacio digital en biofabricación.

Automatización de alimentación de bioprocesamiento habilitada a través de scripts de software

En la bioproducción basada en células, la optimización de la alimentación del cultivo es fundamental para mantener una alta productividad volumétrica y es una parte central del desarrollo de bioprocesos aguas arriba. En este artículo, la autora Ulrike Rasche del SE Bioprocess Center de Eppendorf en Alemania analiza cómo automatizar la alimentación de cultivos con tecnologías digitales para mejorar la eficiencia de los bioprocesos.

La fermentación por lotes alimentados es el modo de operación más común en la industria de bioprocesos, donde las células o los microorganismos se cultivan en sistemas de biorreactores y los nutrientes se agregan gradualmente a lo largo del período de cultivo para mantener las células en la fase de crecimiento exponencial. La limitación del sustrato normalmente dicta el inicio de la alimentación del cultivo, pero es importante que el sustrato no se agregue en exceso para limitar la acumulación de subproductos no deseados mientras se apoya completamente el crecimiento celular.

Ventajas de la automatización en el bioprocesamiento

Clásicamente, los investigadores deben tomar muestras del biorreactor a intervalos de tiempo designados para evaluar el metabolismo de las células y determinar el inicio de la alimentación, pero este método análogo es laborioso y propenso a fallar si se pierden los puntos de tiempo, lo que puede afectar negativamente la productividad del cultivo. Implementar un proceso de alimentación automatizado ofrece numerosas ventajas:

• Prevenir el agotamiento de nutrientes
• Generar un macroentorno más estable
• Alcance mayores rendimientos de productos
• Reducir la carga de trabajo manual
• Mejorar la estandarización

Para implementar de manera efectiva la alimentación automatizada, se necesita un dispositivo que impulse la solución de alimentación en el biorreactor automáticamente y un software de bioprocesamiento programable (por ejemplo, el control DASware®). Por lo general, una bomba de alimentación impulsada por el software de control de bioprocesos con funcionalidad de secuencias de comandos. Los scripts de software son herramientas valiosas para implementar rutinas precisas de control de bioprocesos para permitir la automatización de procesos en condiciones definidas por el usuario. El autor presenta dos estrategias de script de software diseñadas para optimizar el proceso de alimentación de cultivos: alimentación basada en el tiempo y alimentación basada en sensores.

Estrategia 1: Alimentación basada en el tiempo

Aquí, se agrega un volumen definido de solución de alimentación al cultivo en un incremento de tiempo específico en el período de cultivo. Por ejemplo, la alimentación exponencial tiene como objetivo extender la fase de crecimiento exponencial de un cultivo en crecimiento activo para lograr una mayor densidad de biomasa, al tiempo que evita de manera efectiva el agotamiento de los nutrientes y la acumulación de subproductos tóxicos. La velocidad de alimentación se describe mediante el texto del guión introducido en el software de control de bioprocesos que contiene una fórmula que define el perfil de alimentación exponencial.

Estrategia 2: Alimentación basada en sensores

En una estrategia de alimentación basada en sensores, los medios de alimentación se agregan al cultivo en función de una lectura de sensor en línea o en línea que se alimenta al software de control de bioprocesos para crear un ciclo de retroalimentación automatizado. Según el valor del sensor, el script del software activa un actuador, que controla el parámetro de interés del proceso en el punto de referencia. Se pueden usar diferentes parámetros para activar regímenes de alimentación automatizados, incluidos:

• Alimentación basada en un pico de oxígeno disuelto (OD)
• Alimentación basada en la concentración de sustrato (es decir, glucosa)
• Alimentación basada en el cociente respiratorio (el cociente de CO ₂ producido y O ₂ consumido por un cultivo)

Los detalles sobre cómo implementar estas estrategias se describen en el artículo y cómo se pueden implementar scripts de software para crear un control de procesos personalizado.

Fermentación RQ constante controlada por PID de Pichia pastoris en el sistema de minibiorreactor DASbox®

Pichia pastoris es un sistema de expresión de proteínas de uso común en la biofabricación con ventajas sobre Escherichia coli debido a su capacidad para llevar a cabo modificaciones posteriores a la traducción similares a las humanas, como la glicosilación. Además, en comparación con líneas celulares de mamíferos como CHO, P. pastorisla fermentación ofrece una tasa de crecimiento más rápida y utiliza medios de cultivo menos complejos (y costosos), lo que lo hace ideal para la producción de biorreactores a gran escala.

Una de las estrategias clave para optimizar el rendimiento de la producción es afinar la estrategia de alimentación. Con frecuencia se usa un enfoque conveniente y bien establecido basado en sensores activado por un pico de oxígeno disuelto (OD) en los medios de cultivo, pero una nueva investigación indica que la alimentación basada en el cociente respiratorio (RQ) puede proporcionar una mejor productividad y evitar la formación de etanol no deseado.

Este artículo presenta un estudio que demuestra la viabilidad de la alimentación constante basada en RQ utilizando el sistema Eppendorf DASbox Mini Bioreactor en comparación con una estrategia basada en picos de OD. Una unidad analizadora de gases de escape GA4 que incluye sensores de humedad se conectó al biorreactor para medir la concentración de oxígeno (O ₂ ) y dióxido de carbono (CO ₂ ). Se usó un script de alimentación PID basado en RQ automático en el control DASware 5 para activar la alimentación una vez que el valor de RQ cae por debajo de 1, lo que indica que el cultivo ha consumido la glucosa.

Conclusiones del análisis

En comparación con la alimentación basada en DO, el control de la alimentación basado en RQ constante de la fermentación de P. pastoris demostró ser más rentable y rentable, lo que permitió una rápida optimización de la alimentación con una mínima formación de subproductos.

Estrellas en alineación para la inteligencia artificial en bioprocesamiento

El artículo final del libro electrónico examina el uso de la inteligencia artificial (IA) para el desarrollo de procesos y el control de la biofabricación. En la planta de fabricación, la IA se puede utilizar para la automatización de laboratorios, el procesamiento eficiente de documentos y el control de procesos impulsado por el mayor interés (y adopción) de iniciativas de fabricación continua. Según Vikas Revankar, jefe de Software y Automatización de MilliporeSigma, las operaciones continuas basadas en datos ayudarán a mejorar significativamente la calidad del producto, reducir los costos de producción y acortar el tiempo de comercialización.

Debido a que la tecnología de inteligencia artificial y aprendizaje automático (ML) puede detectar patrones en conjuntos de datos complejos que son difíciles de observar para un operador, brinda una nueva vía para obtener información sobre los procesos de producción que se pueden usar para mejorarlos o automatizarlos. Si bien la biotecnología a menudo va a la zaga de otros sectores en la adopción de herramientas digitales, el uso de la tecnología analítica de procesos (PAT) está bien establecido, allanando el camino para la adopción de IA y ML. Muchas empresas ya cuentan con la infraestructura de tecnología de la información para admitir PAT que se puede aprovechar para implementar IA.

Conclusiones

Para aprovechar todo el potencial de estas tecnologías, se necesita acceso a datos para entrenar modelos matemáticos de IA y expectativas regulatorias más claras. Según Jens Smiatek, PhD, experto en inteligencia artificial y gestión de datos de la Universidad de Stuttgart, los principales desafíos para los métodos basados ​​en aprendizaje automático e inteligencia artificial son la falta de pautas para extender su aplicación a entornos GMP. También habrá un requisito para que el personal cultive diferentes conjuntos de habilidades para adaptarse a estas nuevas herramientas y las empresas deben ser conscientes de hacerlas fáciles de usar para capitalizar sus beneficios. Todos los componentes están listos para provocar una revolución de la IA en el bioprocesamiento.

Fuente: Eppendorf

La entrada Mejora de la eficiencia del bioprocesamiento upstream con herramientas digitales se publicó primero en Vigenius Biotech.

Evite piezas internas que requieran reemplazo

Verifique si hay alguna pieza que deba reemplazarse regularmente para el correcto funcionamiento de la incubadora de CO2. Por ejemplo, los filtros HEPA asociados a ventiladores pueden sumar fácilmente hasta 1000 €/1100 dólares en solo cinco años, una fracción de la vida útil esperada del dispositivo.

Busque opciones actualizables en el campo

¿Cambiará la configuración de su laboratorio en el futuro? ¿Se requerirá la documentación de las condiciones de cultivo o incluso el cultivo en condiciones hipóxicas? Si es posible, es mejor estar preparado. Busque un dispositivo con muchas opciones actualizables en el campo para adaptarse de manera flexible a los nuevos requisitos (por ejemplo, control de O2 actualizable para experimentos hipóxicos, monitoreo de humedad o nivel de agua, o una posición de bisagra de puerta cambiable).

¿Qué hay en tu paquete?

Cuando compare cotizaciones de diferentes fabricantes, le recomendamos que verifique qué hay en el paquete. Por ejemplo, ¿cuántos estantes se incluyen en su próximo dispositivo? ¿Está planeando usar el estante superior si el dispositivo tiene un ventilador? ¿Qué tipo de sensor de CO2 se incluye: un sensor TC básico o un sensor IR más avanzado? ¿Se puede apilar el dispositivo con modelos de otros fabricantes con un kit de apilamiento universal?

La limpieza rápida y fácil le ahorrará tiempo

La limpieza regular reduce el riesgo de perder muestras preciosas y repetir experimentos debido a la contaminación. Verifique si su nuevo dispositivo tiene solo unas pocas partes internas para quitar/limpiar y si viene con una cámara suave y sin costuras donde los contaminantes no tienen dónde esconderse.

Consultar por bajo consumo de gas de su incubadora de CO2

A menudo subestimado, el consumo de gas (CO2 y N2, dependiendo de los requisitos) puede ser un factor de costo significativo y superar fácilmente el precio de compra de una incubadora de CO2 durante su vida útil. Esto puede deberse a los costos del gas en sí, pero también al necesario empleo de personal para cambiar con frecuencia los cilindros de gas. Solicite al fabricante datos de consumo de gas, calcule los costos sobre lo esperado de por vida con los precios locales del gas, y tenga en cuenta la frecuencia necesaria para cambiar el cilindro de gas y la mano de obra asociada.

Consejo: Considere también las puertas internas segmentadas.

Comparar capacidades de embarcaciones

La clase de volumen (por ejemplo, 170 L) no le dice mucho sobre el espacio utilizable real. En general, las incubadoras de CO2 con tecnología de calentamiento directo brindan la relación más alta de volumen utilizable versus espacio ocupado, ya que generalmente solo contienen un sistema de estantes, estantes y una bandeja de agua, sin partes internas adicionales como un ventilador, conductos de aire, HEPA asociado al ventilador. – filtros, y otros.

Fuente: Eppendorf

La entrada ¿Cómo identificar una incubadora de CO2 rentable y sostenible? se publicó primero en Vigenius Biotech.

La industria biofarmacéutica está constantemente alcanzando nuevas alturas. Lo que impulsa el éxito continuo del sector es la inversión en una diversa gama de productos y procesos. Desde biosimilares hasta vectores virales y anticuerpos biespecíficos, las empresas buscan diversas modalidades de medicamentos. Pero a medida que las empresas continúan explorando el potencial de estas nuevas vías terapéuticas, también se enfocan en la intensificación del proceso para aumentar la productividad, y eso exige un examen más detallado de las opciones de equipos en todos los pasos del bioprocesamiento. Aquí, Anthony Grabski, líder técnico global de instrumentos y aplicaciones de cromatografía multicolumna (MCC) para Tosoh Bioscience, y Emily Schirmer, directora sénior de desarrollo de procesos de Catalent Biologics explican por qué los próximos lanzamientos de productos MCC de Tosoh: ^Octave®Sistemas BIO y ProGMPTM: pueden ayudar a las empresas a lograr sus objetivos de bioprocesamiento.

¿Cómo están cambiando las necesidades de bioprocesamiento en la industria?
 

 Las empresas ya no quieren ni necesitan lidiar con los grandes equipos de acero inoxidable y los volúmenes de tampón y resina asociados con los procesos por lotes. 

Schirmer: Desde las grandes empresas farmacéuticas hasta los fabricantes por contrato, hay varias tendencias que están cambiando el panorama de la industria. Estamos viendo la adición de biorreactores de mayor volumen, una tendencia hacia el desarrollo optimizado de líneas celulares y un mayor uso de la intensificación de procesos y métodos de procesamiento continuo para impulsar una mayor productividad. Estas tecnologías y enfoques de desarrollo de productos han permitido un aumento significativo en la cantidad de material que se puede generar aguas arriba. Este aumento en el material aguas arriba significa que existe la necesidad de métodos eficientes de purificación aguas abajo, para evitar cuellos de botella y reducir las huellas de fabricación.

¿Qué papel puede jugar MCC?
 

Grabski: MCC se ajusta a la creciente tendencia de la industria de cambiar de procesos por lotes a procesos continuos y cumple con los cuatro principios de diseño para las bioinstalaciones del futuro: rápido, flexible, pequeño y sostenible. Las empresas ya no quieren ni necesitan lidiar con los grandes equipos de acero inoxidable y los volúmenes de tampón y resina asociados con los procesos por lotes. MCC se basa en una serie de columnas pequeñas en lugar de una columna grande, lo que reduce el volumen total de resina requerido hasta en un 90 por ciento. Las diversas operaciones del protocolo del proceso (carga, lavado, elución y limpieza) se realizan simultáneamente en diferentes columnas bajo el control de bombas individuales.

El cambio periódico de las corrientes de entrada y salida a las posiciones de la columna aguas abajo a través de un sistema de válvula ejecuta la progresión de los pasos del proceso en un ciclo continuo.

Mientras la industria busca superar los cuellos de botella que pueden ocurrir durante la intensificación de procesos, creo que MCC puede ofrecer una solución pertinente. 

En última instancia, MCC abre los cuellos de botella que las empresas suelen experimentar y proporciona ventajas económicas significativas sobre los métodos por lotes tradicionales para la purificación de mAb, que incluyen una productividad aumentada de 3 a 10 veces, una utilización de la capacidad de la resina del 85 al 95 por ciento, un consumo de tampón reducido del 30 al 50 por ciento, reducción de la columna. volumen y patines de proceso versátiles más pequeños.

¡Todo muy impresionante! Pero lo que hace que la tecnología MCC sea más importante para mí son los pacientes tratados con los mAbs y las terapias biológicas fabricadas con ellos. Espero que MCC haga que los medicamentos biológicos sean más asequibles y estén disponibles, produciendo tratamientos de la más alta calidad, más seguros y más efectivos posibles para quienes los necesitan.

Schirmer: La proteína A puede ser costosa y, a menudo, requiere una gran inversión inicial para establecer el proceso posterior. La inversión necesaria para matrices de cromatografía caras es una limitación para muchos de nuestros socios, especialmente para las pequeñas empresas de biotecnología. Pero esto se puede evitar usando MCC porque reduce el uso de resina. Mientras la industria busca superar los cuellos de botella que pueden ocurrir durante la intensificación de procesos, creo que MCC puede ofrecer una solución pertinente.

¿Cuál es la historia detrás del próximo lanzamiento de MCC de Tosoh?
 

Grabski: Los sistemas Octave ^® BIO y ProGMPTM se basan en la tecnología MCC desarrollada por Semba Biosciences. La investigación interna de Semba se centró en el desarrollo de métodos de MCC para la captura de mAbs de Proteína A. Después de evaluar muchas resinas de proteína A comerciales, Semba descubrió que TOYOPEARL ^® AF-rProtein A HC-650F de Tosoh Bioscience tenía la mejor combinación de capacidad, propiedades de flujo y pureza del producto resultante para lograr las productividades más altas cuando se usa en los sistemas MCC de Semba. Estos hallazgos y otros resultados superiores de MCC utilizando otras resinas TOYOPEARL para el pulido de mAb llevaron a una sólida asociación con Tosoh Bioscience, y luego a la adquisición de Semba por parte de Tosoh en 2021.

El nuevo Octave ^® BIO funciona especialmente bien con las columnas preempaquetadas SkillPak de Tosoh Bioscience; esta poderosa combinación ofrece a los clientes una solución de fuente única para el desarrollo de procesos de MCC sólido, flexible y rápido.

¿Qué distingue a estos sistemas?
 

Grabski: Los sistemas Octave ^® BIO y ProGMPTM combinados con la resina TOYOPEARL ^® AF-rProtein A HC- 650F permiten velocidades de flujo de >600 cm/h y un tiempo de residencia de carga de tan solo 0,25 min para la adsorción de proteína A del mAb frente a 4 min o más en un proceso por lotes de una sola columna. Como todos los pasos que no son de carga se llevan a cabo simultáneamente en las otras columnas, no hay demora en completar cada paso. La captura completa de Proteína A se logra con mayor velocidad y eficiencia que con un proceso de una sola columna. La flexibilidad se logra ajustando el número de columna, el tamaño y la configuración para adaptarse a las propiedades de alimentación y adsorbente, adaptarse a todos los pasos del proceso y satisfacer los requisitos de tiempo de ejecución.

¿Cómo se benefician los clientes de los sistemas?
 

Schirmer: Catalent había estado considerando alternativas a la cromatografía por lotes tradicional para abordar la intensificación del proceso aguas arriba. Y así surgió nuestra asociación con Tosoh. Trabajamos con los sistemas MCC de Tosoh y completamos varias ejecuciones a escala piloto y de fabricación. Los resultados ilustraron claramente el potencial para lograr ahorros significativos de tiempo y costos para nuestros socios. La automatización que brindan los sistemas también es beneficiosa para el fabricante con respecto al tiempo del operador.

¿Cómo pueden las empresas obtener más información sobre MCC?
 

Grabski: Durante los últimos tres años, Tosoh ha estado invirtiendo en la infraestructura de soporte para ayudar a educar a los usuarios actuales y futuros de MCC, tanto con ofertas virtuales como presenciales. Tosoh Bioscience ha creado su Centro de excelencia de MCC en Madison, Wisconsin, y ha ampliado la sede de EE. UU. en King of Prussia, Pensilvania, para incluir un laboratorio de demostración y un centro de formación dedicado a la educación de MCC. También estamos invirtiendo en un conjunto similar de Centros de excelencia y Laboratorios de aplicaciones en otras oficinas en todo el mundo. La plataforma está ayudando a educar y apoyar a la industria desde el laboratorio hasta el campo.

Fuente: https://themedicinemaker.com/manufacture/high-intensity-purification

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Aumento del rendimiento de hiPSC en el cultivo de células madre en biorreactores

Robert Zweigerdt de la Escuela de Medicina de Hannover explica cómo su equipo aumentó considerablemente el rendimiento de hiPSC en el cultivo de células madre en biorreactores.

Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y su progenie diferenciada proporcionan el conjunto de herramientas para enfoques innovadores en medicina regenerativa. Los biorreactores de tanque agitado son sistemas de cultivo prometedores, ya que tienen la capacidad de producir un alto número de células, lo que permite oportunidades de ampliación y de vanguardia para mejorar el control de los parámetros de crecimiento, con numerosos beneficios, el principal de los cuales es una mejor reproducibilidad del cultivo.

El aumento de la densidad celular es un componente vital de la investigación en bioprocesamiento de células madre. En esta entrevista, el Dr. Robert Zweigerdt de la Facultad de Medicina de Hannover, Alemania, explica cómo su equipo alcanzó un rendimiento de cultivo de 35 millones de hiPSC por ml.

Eppendorf: Su grupo tiene experiencia establecida en el cultivo de hiPSC como agregados celulares en biorreactores de tanque agitado. En su última publicación, informó haber alcanzado una densidad celular de 35 millones de células por ml. ¡Eso es un gran salto! ¿Qué obstáculos importantes tuviste que superar para alcanzar este hito?

RZ: El primer obstáculo, que atacamos hace una década, fue apoyar la supervivencia y proliferación de hiPSC sembradas en un cultivo en suspensión sin matriz tridimensional (3D), en contraste con los protocolos de cultivo establecidos que emplean cultivo en monocapa dependiente de matriz 2D en Platos y tarimas de cultivo convencionales ^{1, 2} .

El segundo gran paso, realizado en colaboración con su empresa, fue el diseño de un impulsor de agitación modificado que admitía una agregación hiPSC ³ más homogénea y, posteriormente, un sistema de «filtro de retención». Dichos sistemas de retención permiten mantener las células hPS, que forman agregados multicelulares en cultivo en suspensión agitada, en el biorreactor con alimentación de perfusión automatizada, definida como el reemplazo constante del medio usado por medio fresco ⁴ .

Posteriormente, la alimentación por perfusión fue el requisito previo para nuestro último paso: es decir, la identificación de parámetros limitantes del crecimiento, como la dependencia del pH, el consumo de glucosa y la acumulación de lactato. Habiendo identificado estos cuellos de botella que limitan el crecimiento, se realizó un monitoreo basado en retroalimentación que requiere el control del rendimiento total del medio a través de la alimentación por perfusión. El Dr. Felix Manstein, de nuestro departamento, que estaba impulsando estas investigaciones en los últimos años, también ha implementado estrategias de modelado y optimización de procesos in silico , que facilitan el desarrollo racional de procesos de bioprocesamiento de alta densidad de hiPSCs ⁵ .Biorreactor de un solo uso BioBLU 0.3 sc equipado con impulsor de 8 palas.

Eppendorf: Para un uso prospectivo en terapias avanzadas, las hiPSC deben diferenciarse en el tipo de célula deseado. ¿Qué tan sencillo fue traducir los protocolos de diferenciación que se diseñaron para cultivos monocapa a agregados celulares en biorreactores?

RZ: Desde que iniciamos el desarrollo de estrategias de diferenciación específicas de linaje en suspensión hace varios años, poco después de la primera cultura hiPSC exitosa en 3D ⁶ , también hemos establecido un grado sustancial de competencia en esa área. Los desafíos más importantes con respecto a la diferenciación dirigida en cultivo en suspensión incluyen el impacto del tamaño de los agregados celulares, su heterogeneidad, la densidad celular general y la definición de parámetros mecánicos e hidrodinámicos ⁷ .

Sin embargo, también observamos que los componentes de los medios de cultivo estándar y las moléculas directoras de diferenciación que estamos aplicando, como por ejemplo los moduladores de la vía WNT, utilizados para la inducción del mesendodermo y la diferenciación cardíaca, tienen efectos equivalentes en 2D y en 3D ⁸ . Por lo tanto, la transición del proceso de 2D, que a menudo se aplica para la investigación básica de diferenciación celular, a la cultura de suspensión 3D suele ser sencilla. Sin embargo, estamos convencidos de que en el futuro muchas estrategias de diferenciación se beneficiarán de las capacidades avanzadas de control de procesos habilitadas por las tecnologías de biorreactores, aún en las primeras etapas de desarrollo ⁹ .

En particular, demostramos que la diferenciación de hiPSC basada en biorreactor de tanque agitado es aplicable de manera eficiente no solo para la difracción cardíaca (como se destaca en las referencias anteriores) sino también para la diferenciación y producción de muchas otras progenies de hiPSC funcionales, incluidas las células endoteliales ¹⁰ macrófagos ¹¹ y endodérmicos derivados ¹² .

Eppendorf: En el bioprocesamiento previo, la estrategia de alimentación tiene un gran impacto en el crecimiento y la viabilidad de las células. Los lotes repetidos y la perfusión son dos opciones para eliminar los subproductos y reponer los nutrientes. ¿Cuáles considera que son los pros y los contras de estas dos estrategias?

RZ: Como se mencionó anteriormente, nuestra experiencia sugiere que la alimentación por perfusión, a pesar de su complejidad, es la táctica óptima para el cultivo avanzado de hPSC ¹³ . Esto se debe al metabolismo altamente glucolítico de la hPSC de rápido crecimiento, que, por un lado, requiere un enorme suministro de glucosa adicional para evitar la inanición que limita el crecimiento. Además, por otro lado, la suplementación alta en glucosa da como resultado una acumulación masiva de lactato secretado, que puede volverse tóxico y que induce una acidificación inhibidora de la proliferación del cultivo. Estos problemas aumentan exponencialmente en paralelo al aumento exponencial de la densidad celular ⁵.

Por estas razones, creemos que la alimentación por perfusión es la estrategia más exitosa para controlar los parámetros limitantes del crecimiento, si el objetivo del protocolo es optimizar el cultivo de alta densidad de hiPSC. En particular, en paralelo al aumento de 10 veces en la densidad celular, la cantidad de medio necesaria para generar un número determinado de células se redujo en un 70 % como consecuencia de los pasos de optimización del proceso.La alimentación por perfusión permite el control de los parámetros limitantes del crecimiento

Eppendorf: En unos pocos años, pudo aumentar la densidad de cultivo hiPSC más de diez veces. ¿Cómo optimizó su proceso para obtener este valor?

RZ:Hace un par de años, obtuvimos 2,85 millones de hiPSC por ml luego de la inoculación con 0,5 millones de células por ml. Recientemente, obtuvimos una densidad celular más de 10 veces mayor después de una densidad de inoculación comparable. Seguimos una estrategia paso a paso, analizamos sistemáticamente los desafíos y luego aplicamos el control combinado de los parámetros habilitado por el biorreactor, superando así los obstáculos que limitan el crecimiento. Los cuellos de botella específicos incluyen: promover la supervivencia y agregación eficientes de hiPSC después de la inoculación del proceso basado en una sola célula, la adaptación adecuada de la velocidad de agitación para garantizar que no se agrupen las hiPSC y la reducción del diámetro del agregado por debajo de ~300 µm. Luego, evitando la caída del pH por debajo de alrededor de 6.7,⁵ .

Sin embargo, una vez que se identifican estas limitaciones, pueden controlarse sistemáticamente a través del software de control de bioprocesos y optimizarse en combinación con el modelado de procesos in silico ; detalles en nuestro protocolo más reciente ¹⁴ .En los biorreactores, los parámetros del proceso se pueden controlar de cerca

Eppendorf: Pudiste generar 5250 millones de hiPSC en un volumen de 150 ml. ¿Cómo se compara ese número con el número de células requeridas para aplicaciones de terapia celular, por ejemplo, para el corazón? ¿Ve la necesidad de una futura ampliación?

RZ: A pesar de este progreso sustancial del bioprocesamiento de hiPSC pluripotentes e indiferenciadas, todavía estamos trabajando para aumentar aún más la densidad celular y, por lo tanto, el rendimiento de células diferenciadas, incluidos los cardiomiocitos derivados de hiPSC. Si bien hemos logrado una pureza de linaje muy alta, por ejemplo, > 95 % de cardiomiocitos iPSC, la densidad celular obtenida del protocolo de diferenciación sigue siendo relativamente baja; actualmente ca. _ 1-2×10 ⁶ células por ml ⁸ . Dado que las estimaciones sugieren que para el reemplazo de los miocitos cardíacos agotados por la enfermedad, alrededor de 1-2×10 ⁹Se requerirán iPSC-cardiomiocitos para cada paciente, actualmente requeriríamos alrededor de un cultivo de 1 litro para proporcionar la dosis de células adecuada para un paciente individual.

Los investigadores de medicina regenerativa están discutiendo la posibilidad de generar lotes de células muy grandes para un enfoque de trasplante alogénico, no específico del paciente, por lo que creemos que sería apropiado seguir un programa de mejora sustancial en el futuro. Este objetivo apuntaría a volúmenes de cinco, diez, veinte, cien veces y, finalmente, niveles aún mayores.

Dicha estrategia de mejora también es muy atractiva desde una perspectiva comercial, que incluye la transición a condiciones GMP totalmente controladas requeridas para el cumplimiento normativo y la traducción clínica.

En relación al cultivo de células madre en biorreactores, otro enfoque prometedor es el «cultivo de células sanguíneas», como por ejemplo la diferenciación de macrófagos funcionales de hiPSC. Como demostramos recientemente en colaboración con el grupo de Ncio Lachmann en el campus de la Escuela de Medicina de Hannover, este enfoque, en contraste con la producción por lotes de cardiomiocitos hiPSC, es compatible con la producción continua de macrófagos en biorreactores de tanque agitado durante varias semanas o más. incluso meses ¹¹ .

Eppendorf: Teniendo en cuenta la densidad celular, ¿todavía ve margen de mejora? ¿Cuáles son los factores limitantes?

RZ : Como se indicó anteriormente, vemos margen de mejora para el bioprocesamiento de progenies hiPSC diferenciadas. Los factores (limitantes) para la diferenciación son aún más complejos en comparación con la expansión de hiPSC en el estado pluripotente. Las razones de esto incluyen la mayor complejidad de los procesos de diferenciación, ya que las células cambian constantemente su estado de progenitores y fenotipo y, por lo tanto, su fisiología y propiedades de proliferación. Estamos trabajando intensamente para desarrollar condiciones de proceso específicas de linaje que expresen numerosos linajes diferentes.

¡Es una tarea desafiante pero, por lo tanto, inspirador y emocionante!
 

Referencias:

[1] Cultivo en suspensión inoculado de células individuales de aumento de escala de células madre embrionarias humanas. Singh H, et al. Res. de células madre 2010 mayo;4(3):165-79. doi: 10.1016/j.scr.2010.03.001. Epub 2010 Mar 12.
[2] Expansión escalable de células madre pluripotentes humanas en cultivo en suspensión. Zweigerdt R, et al. Protocolo Nat. 2011 mayo;6(5):689-700. doi: 10.1038/nprot.2011.318. Epub 2011 Apr 28.
[3] Cultivo en suspensión de células madre pluripotentes humanas en biorreactores agitados controlados. Olmer R, et al. Tissue Eng Parte C Métodos. 2012 octubre; 18 (10): 772-84. doi: 10.1089/ten.TEC.2011.0717. Epub 2012 4 de junio.
[4] Impacto de las estrategias de alimentación en la expansión escalable de células madre pluripotentes humanas en biorreactores de tanque agitado de un solo uso. Kropp C, et al. Células madre Transl Med. 2016 octubre; 5 (10): 1289-1301. doi: 10.5966/sctm.2015-0253. Epub 2016 Jul 1.
[5] Bioprocesamiento de alta densidad de células madre pluripotentes humanas mediante control metabólico y modelado in silico. Manstein F, et al. Células madre Transl Med. 2021 julio; 10 (7): 1063-1080. doi: 10.1002/sctm.20-0453. Epub 2021 Mar 4.

Referencias:

[6] Control de expansión y diferenciación cardiomiogénica de células madre pluripotentes humanas en cultivo de suspensión escalable. Kempf H, et al. Informes de células madre. 2014 9 de diciembre; 3 (6): 1132-46. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.09.017. Epub 2014 30 de octubre.
[7] Diferenciación cardíaca de células madre pluripotentes humanas en cultivo en suspensión escalable. Kempf H, et al. Protocolo Nat. 2015 de septiembre; 10 (9): 1345-61. doi: 10.1038/nprot.2015.089. Epub 13 de agosto de 2015.
[8] El control WNT continuo permite el procesamiento cardíaco hPSC avanzado y la identificación de marcadores de superficie de pronóstico en cultivos de suspensión químicamente definidos. Halloin C, et al. Informes de células madre. 13 de agosto de 2019; 13 (2): 366-379. doi: 10.1016/j.stemcr.2019.06.004. Epub 2019 Jul 25.
[9] Predicción del resultado de la diferenciación cardíaca de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante el modelado de procesos multifactoriales. Williams B, et al. Frente Bioeng Biotechnol. 23 de julio de 2020; 8:851. doi: 10.3389/fbioe.2020.00851. eCollection 2020.
[10] Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en células endoteliales funcionales en cultivo en suspensión escalable. Olmer R, et al. Informes de células madre. 2018 8 de mayo; 10 (5): 1657-1672. doi: 10.1016/j.stemcr.2018.03.017. Epub 2018 Apr 19.
[11] La producción en masa basada en biorreactores de macrófagos humanos derivados de iPSC permite inmunoterapias contra infecciones bacterianas de las vías respiratorias. Ackermann M, et al. Nat Comun. 30 de noviembre de 2018; 9 (1): 5088. doi: 10.1038/s41467-018-07570-7.

Referencias:

[12] Producción escalable, libre de xeno y definida químicamente de agregados de endodermo definitivos derivados de hPSC con potencial de diferenciación de múltiples linajes. Sahabian A, et al. Células. 4 de diciembre de 2019; 8 (12): 1571. doi: 10.3390/celdas8121571.
[13] Avances y desafíos en la expansión a gran escala de células madre pluripotentes humanas Christina Kropp C, et al. Process Biochemistry Volumen 59, Parte B, agosto de 2017, páginas 244-254.
[14] Control de procesos y estrategias de modelado in silico para permitir el cultivo de alta densidad de células madre pluripotentes humanas en biorreactores de tanque agitado. Manstein F, et al. Protocolos STAR, 9 de diciembre de 2021; 2 (4): 100988. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100988. eCollection 2021 17 de diciembre.

Fuente: https://handling-solutions.eppendorf.com/cell-handling/bioprocess/processes-and-applications/detailview/news/stem-cell-cultivation-in-bioreactors-increasing-hipsc-yield/?utm_source=linkedin&utm_medium=link&utm_campaign=hq%3Bbioprocess%3Btraffic&utm_term=unspecified%3Bsingle_image%3Bunspecified&utm_content=glo%3Ben%3Buba%3Bbioprocess%3Bbioproc_small_scale

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En los últimos años, los sistemas de un solo uso se han convertido en un estándar cada vez más establecido en la industria biofarmacéutica, lo que no sorprende. Después de todo, hay  ventajas de las tecnologías Single Use como flexibilidad, costos más bajos y consumo de energía reducido.

En Single Use Support estamos enfocados en el desarrollo de sistemas de un solo uso y todo el proceso logístico de líquidos medicinales en bolsas de un solo uso. Nuestra tecnología de un solo uso comprende sistemas avanzados para todo el proceso, desde aguas abajo hasta el llenado y acabado, y es compatible con bolsas de un solo uso de varios tamaños y de cualquier fabricante establecido.

Incluye una prueba de integridad totalmente automatizada para bolsas de un solo uso, bandejas máximamente compactas y confiables, una solución flexible y rápida de llenado y drenaje, unidades de congelación y descongelación basadas en placas para estudios de estabilidad y lotes pequeños a grandes, así como altamente Contenedores robustos, apilables y refrigerables para transporte y almacenamiento.

Según un artículo en marketresearch.com , el uso de tecnologías de un solo uso ofrece a la industria biofarmacéutica 6 ventajas significativas que conducirán a una tasa de crecimiento anual esperada global (CAGR) del 17,8% entre 2016 y 2021:

1. Bajos costos de producción

A diferencia de los sistemas de biorreactores, las instalaciones de un solo uso son más fáciles de mantener. Los costos de etapas de producción complejas como la limpieza (CIP) y la esterilización (SIP) se anulan cuando se utilizan tecnologías de un solo uso , lo que ahorra costos y recursos.

Estos ahorros directos en costes de material y mano de obra son una de las principales ventajas de los sistemas de un solo uso. Se pueden minimizar los costos de mano de obra directa para la instalación, así como los costos de agua y productos químicos. Además, las instalaciones no requieren limpieza ni esterilización, lo que a su vez conduce a una vida útil prolongada y una mayor reducción del costo total de propiedad.

Además, los sistemas de un solo uso ayudan a reducir la inversión inicial y los costes de I+D , lo que supone una gran ventaja dada la demanda cada vez mayor de productos biofarmacéuticos. Los costos de inversión inicial son aproximadamente un 40% más bajos que el precio de una instalación de acero inoxidable comparable.

2. Aumento de la productividad

Para las empresas biofarmacéuticas, el uso de tecnologías de un solo uso conduce a un aumento de la productividad. Los costes y la complejidad de la automatización se reducen notablemente . Se pueden omitir pasos complejos como la limpieza y la validación entre las distintas etapas de producción.

Tradicionalmente, la producción de productos biofarmacéuticos requiere biorreactores a base de acero. Estos deben limpiarse y esterilizarse a fondo para la producción de bioproductos libres de contaminación, lo que aumenta los costos para el fabricante.

3. Eliminación sencilla

Como ya se mencionó, el mantenimiento es el principal diferenciador entre las tecnologías de un solo uso y las instalaciones biofarmacéuticas tradicionales. Como los sistemas de un solo uso son desechables, no requieren una limpieza y desinfección complicadas, sino que pueden desecharse inmediatamente después de su uso.

4. Reducción del consumo de energía y agua

La transición de los dispositivos tradicionales a los sistemas de un solo uso conduce a una disminución evidente en el consumo de energía y agua . Las instalaciones de producción biofarmacéutica que utilizan tecnologías de un solo uso podrían reducir su consumo total de agua y energía en un 46 % en comparación con los reactores de acero inoxidable. Además, las instalaciones de un solo uso tienen una huella de CO2 un 35 % menor que los reactores de acero inoxidable.

5. Ahorro de tiempo

En general, los sistemas de un solo uso están diseñados y dimensionados para vías de líquido desechables, lo que permite una instalación rápida y fácil . Esto ahorra tiempo y costos en términos de preparación, implementación, validación y documentación. El cese de los pasos CIP y SIP conduce a una duración del proyecto de al menos ocho meses más corta para la implementación de instalaciones de producción de un solo uso en lugar de reactores de acero inoxidable.

6. Riesgo reducido de contaminación cruzada

La ultima pero no menos importante de las ventajas de las tecnologías Single Use. La prevención de la contaminación cruzada es uno de los mayores desafíos a los que se enfrenta la industria biofarmacéutica. El riesgo de contaminación es particularmente alto si se fabrican diferentes anticuerpos y/o proteínas en la misma instalación.

La contaminación conduce a una pérdida de sustancia farmacológica y requiere pasos de limpieza adicionales. En el peor de los casos, la contaminación cruzada puede conducir a un tratamiento potencialmente letal de los pacientes. Con la eliminación de la ruta del líquido después de cada lote, la tecnología de un solo uso ayuda a superar este desafío; así, la contaminación cruzada se vuelve prácticamente imposible.

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